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GC/MS를 이용한 미생물 metabolites 분석관련 질문입니다.
이름 : 김태경 \| 작성일 : 2011.10.10 19:53 \| 조회수 : 22158

안녕하세요. 저는 연세대학교 화공생명공학과 대학원에서 석사과정을 밟고 있는 학생입니다. 저는 GC/MS를 사용하여 미생물의 대사물질 성분분석을 하고 있습니다. 그런데 저희 연구실은 GC/MS 기기를 보유하고 있지 않아, 타연구소나 대학 공동기기원에 분석을 의뢰해야하는 실정입니다. 대사물질 분석 서비스를 제공하는 연구소를 찾던 중에 한국분석기술연구소를 찾게 되었고,제 분석에 관련하여 질문사항이 있어 이렇게 글올립니다. (앞으로 질문사항에는 번호를 붙이도록 하겠습니다.) 저는 일단 extracellular metabolites만 분석하는 것을 목표로 하고 있고, metabolites의 유도체화를 위해 두 가지 방법을 고려하고 있습니다. 첫째, MCF(methyl chloroformate)를 이용한 alkylation법 : 유기산, 아미노산, 뉴클레오티드 분석에 용이 둘째, ethoxyamine hydrochloride와 MSTFA(N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide)를 이용한 oximation-silylation법 : 당, 당유도체, 페놀, 기본적인 카복실산, 지방산, 아미노산, 유기산 분석에 용이 각각의 방법에 대해서 질문 사항이 있는데요. 첫번째 방법은 유도체화 반응시 수산화나트륨으로 pH를 조절한 시료에 용매로 메탄올을, 촉매로 피리딘을 넣어준뒤 MCF를 가하여 유도체화 반응을 시키게 됩니다.(친핵성 치환반응이 일어납니다. 반응 메커니즘에 대한 그림을 첨부했습니다.) 여기서 샘플:용매:촉매의 부피비는 6:5:1 입니다. 그런데 타 대학 공동기기원에서 시행한 GC/MS 분석 결과, metabolites에 해당하는 peak들에 비하여 피리딘 peak의 abundance가 너무 높게 나타나서 피리딘을 제거하고 싶습니다. 하지만 피리딘이 촉매로서 얼마나 효율적으로 작용하는지에 대한 정보를 찾지 못하여 섣불리 피리딘을 제거하지 못하고 있습니다. 1. 보통 위에 말씀드린 친핵성 치환반응에서, 피리딘이 없어도 반응이 진행되는데에 큰 문제가 없을까요? 두번째 방법은 제가 참고한 프로토콜 상에 추출과정이 포함되어 있지 않아, 배지내 성분들이 유도체화된 물질과 함께 컬럼에 주입되어 악영향을 미치게 됩니다. 20번 주입때 마다 컬럼을 교체해줘야 한다는 내용을 논문에서 접한바 있습니다. 그래서 유도체화 반응을 시키기 전에 ethylacetate(EA)나 metylene chloride(MC)를 시료에 가하여 metabolites만 추출한 후에 유도체화 반응 시키는 방법을 생각하고 있습니다. 그런데 추출한 용액을 농축하여 유도체화 반응시킨뒤 GC/MS로 분석하는 것이 미생물 대사물질 분석에 적합한지 확신이 들지 않아 이렇게 질문 드립니다. 우선 위의 유기용매를 이용하면 TCA cycle이나 pentose phosphate cycle, glycolysis 대사경로에 포함된 유기산이나 당인산염, 당, 아미노산 등이 충분히 추출될 수 있는지 궁금합니다. 또한 유기용매를 가열하여 날릴경우 metabolites의 손실이 발생하는지 궁금합니다.(대부분의 논문에 metabolites는 열에 대한 안정도가 떨어진다고 언급되어 있어서요) 일반적으로 metabolites 분석시에는 농축을 위해 동결건조를 사용하는데요, 위에 언급한 용매들은 어는점이 낮아서 동결건조가 어려울 거라는 연구실 선배의 조언을 듣고나서 용매를 제거하는 방법에 대해서도 고민이 됩니다. 2. 제가 관심있는 물질들이 EA나 MC로 효과적으로 추출될 수 있는지, 이들의 손실을 줄이기 위해서는 용매를 어떤 방식으로 날려야 할까요? 또한 두번째 유도체화 방법을 이용할 경우, 유도체화된 물질들이 물에 의해 가수분해 될 수 있습니다. 따라서 유도체화 반응 중이나, 반응 후에 시료를 보관, 운반할시에도 수분과의 접촉을 최대한 피해야 합니다. 3. GC 바이알에 시료를 넣고 PTFE/Si으로 sealing된 뚜껑을 닫은뒤, 중탕으로 가열하여도 문제가 없을까요? 4. 반응이 끝난 시료를 보관, 운반할 시에 파라필름으로 동봉하면 물과의 접촉을 막을 수 있을까요? 바쁜 시간 할애하여 주셔서 감사합니다. 그럼 답변 부탁드리면서 이만 줄이겠습니다.
IP : 165.132.129.***

안녕하세요.

저는 연세대학교 화공생명공학과 대학원에서 석사과정을 밟고 있는 학생입니다.

저는 GC/MS를 사용하여 미생물의 대사물질 성분분석을 하고 있습니다.

그런데 저희 연구실은 GC/MS 기기를 보유하고 있지 않아,

타연구소나 대학 공동기기원에 분석을 의뢰해야하는 실정입니다.

대사물질 분석 서비스를 제공하는 연구소를 찾던 중에 한국분석기술연구소를 찾게 되었고,제 분석에 관련하여 질문사항이 있어 이렇게 글올립니다.
(앞으로 질문사항에는 번호를 붙이도록 하겠습니다.)

저는 일단 extracellular metabolites만 분석하는 것을 목표로 하고 있고, metabolites의 유도체화를 위해 두 가지 방법을 고려하고 있습니다.

첫째, MCF(methyl chloroformate)를 이용한 alkylation법 : 유기산,
아미노산, 뉴클레오티드 분석에 용이

둘째, ethoxyamine hydrochloride와 MSTFA(N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide)를 이용한 oximation-silylation법
: 당, 당유도체, 페놀, 기본적인 카복실산, 지방산, 아미노산, 유기산
분석에 용이

각각의 방법에 대해서 질문 사항이 있는데요.

첫번째 방법은 유도체화 반응시 수산화나트륨으로 pH를 조절한 시료에 용매로 메탄올을, 촉매로 피리딘을 넣어준뒤 MCF를 가하여 유도체화 반응을 시키게 됩니다.(친핵성 치환반응이 일어납니다. 반응 메커니즘에 대한 그림을 첨부했습니다.)

여기서 샘플:용매:촉매의 부피비는 6:5:1 입니다.

그런데 타 대학 공동기기원에서 시행한 GC/MS 분석 결과, metabolites에 해당하는 peak들에 비하여 피리딘 peak의 abundance가 너무 높게 나타나서 피리딘을 제거하고 싶습니다.

하지만 피리딘이 촉매로서 얼마나 효율적으로 작용하는지에 대한 정보를 찾지 못하여 섣불리 피리딘을 제거하지 못하고 있습니다.

1. 보통 위에 말씀드린 친핵성 치환반응에서, 피리딘이 없어도 반응이 진행되는데에 큰 문제가 없을까요?

두번째 방법은 제가 참고한 프로토콜 상에 추출과정이 포함되어 있지 않아, 배지내 성분들이 유도체화된 물질과 함께 컬럼에 주입되어 악영향을 미치게 됩니다.

20번 주입때 마다 컬럼을 교체해줘야 한다는 내용을 논문에서 접한바 있습니다. 그래서 유도체화 반응을 시키기 전에 ethylacetate(EA)나 metylene chloride(MC)를 시료에 가하여 metabolites만 추출한 후에 유도체화 반응 시키는 방법을 생각하고 있습니다.

그런데 추출한 용액을 농축하여 유도체화 반응시킨뒤 GC/MS로 분석하는 것이 미생물 대사물질 분석에 적합한지 확신이 들지 않아 이렇게 질문 드립니다.

우선 위의 유기용매를 이용하면 TCA cycle이나 pentose phosphate cycle, glycolysis 대사경로에 포함된 유기산이나 당인산염, 당, 아미노산 등이 충분히 추출될 수 있는지 궁금합니다.

또한 유기용매를 가열하여 날릴경우 metabolites의 손실이 발생하는지 궁금합니다.(대부분의 논문에 metabolites는 열에 대한 안정도가 떨어진다고 언급되어 있어서요)

일반적으로 metabolites 분석시에는 농축을 위해 동결건조를 사용하는데요,
위에 언급한 용매들은 어는점이 낮아서 동결건조가 어려울 거라는 연구실 선배의 조언을 듣고나서 용매를 제거하는 방법에 대해서도 고민이 됩니다.

2. 제가 관심있는 물질들이 EA나 MC로 효과적으로 추출될 수 있는지, 이들의 손실을 줄이기 위해서는 용매를 어떤 방식으로 날려야 할까요?

또한 두번째 유도체화 방법을 이용할 경우, 유도체화된 물질들이 물에 의해 가수분해 될 수 있습니다. 따라서 유도체화 반응 중이나, 반응 후에 시료를 보관, 운반할시에도 수분과의 접촉을 최대한 피해야 합니다.

3. GC 바이알에 시료를 넣고 PTFE/Si으로 sealing된 뚜껑을 닫은뒤, 중탕으로 가열하여도 문제가 없을까요?

4. 반응이 끝난 시료를 보관, 운반할 시에 파라필름으로 동봉하면 물과의 접촉을 막을 수 있을까요?

바쁜 시간 할애하여 주셔서 감사합니다.

그럼 답변 부탁드리면서 이만 줄이겠습니다.

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